Osteoartritis (OA) je jedna od dugotrajnih hroničnih degenerativnih bolesti zglobova kostiju koja pogađa populaciju starije od 65 godina [
1]. Općenito, pacijentima s OA dijagnosticira se oštećena hrskavica, upaljena sinovija i erodirani hondrociti, što izaziva bol i fizički stres [
2]. Artritična bol je pretežno uzrokovana degeneracijom hrskavice u zglobovima upalom, a kada je hrskavica ozbiljno oštećena, kosti se mogu sudarati jedna s drugom uzrokujući nepodnošljiv bol i fizičke poteškoće [
3]. Učešće medijatora upale sa simptomima kao što su bol, oticanje i ukočenost zgloba je dobro dokumentirano. Kod pacijenata sa OA, upalni citokini, koji uzrokuju eroziju hrskavice i subhondralne kosti nalaze se u sinovijalnoj tekućini [
4]. Dvije glavne pritužbe koje pacijenti s OA općenito imaju su bol i upala sinovijalne šupljine. Stoga su primarni ciljevi trenutnih OA terapija smanjenje boli i upale. [
5]. Iako su dostupni tretmani za OA, uključujući nesteroidne i steroidne lijekove, dokazano djelotvorni u ublažavanju boli i upale, dugotrajna upotreba ovih lijekova ima ozbiljne zdravstvene posljedice kao što su kardiovaskularne, gastrointestinalne i bubrežne disfunkcije [
6]. Stoga se za liječenje osteoartritisa mora razviti efikasniji lijek sa manje nuspojava.
Prirodni zdravstveni proizvodi postaju sve popularniji jer su sigurni i lako dostupni [
7]. Tradicionalni korejski lijekovi su dokazano djelotvorni protiv nekoliko upalnih bolesti, uključujući artritis [
8]. Aucklandia lappa DC. poznat je po svojim ljekovitim svojstvima, kao što je poboljšanje cirkulacije qi-ja za ublažavanje bolova i umirenje želuca, a tradicionalno se koristio kao prirodni analgetik [
9]. Raniji izvještaji sugeriraju da A. lappa posjeduje protuupalno [
10,
11], analgetik [
12], antikancer [
13], i gastroprotektivni [
14] efekti. Različite biološke aktivnosti A. lappa uzrokovane su njenim glavnim aktivnim spojevima: kostunolid, dehidrokostus lakton, dihidrokostunolid, kostulakton, α-kostol, saussurea lakton i kostulakton [
15]. Ranije studije tvrde da je kostunolid pokazao protuupalna svojstva u lipopolisaharidu (LPS), koji je inducirao makrofage kroz regulaciju NF-kB i put proteina toplotnog šoka [
16,
17]. Međutim, nijedna studija nije istraživala potencijalne aktivnosti A. lappa za liječenje OA. Ovo istraživanje je istraživalo terapeutske efekte A. lappa protiv OA koristeći (mononatrijum-jodoacetat) MIA i modele glodara izazvanih octenom kiselinom.
Mononatrijum-jodoacetat (MIA) se čuveno koristi za izazivanje većine bolnih ponašanja i patofizioloških karakteristika OA kod životinja [
18,
19,
20]. Kada se ubrizgava u zglobove koljena, MIA poremeti metabolizam hondrocita i izaziva upalu i upalne simptome, kao što su erozija hrskavice i subhondralne kosti, kardinalni simptomi OA [
18]. Odgovor na grčenje izazvan octenom kiselinom široko se smatra simulacijom perifernog bola kod životinja gdje se upalni bol može kvantitativno izmjeriti [
19]. Ćelijska linija makrofaga miša, RAW264.7, popularno se koristi za proučavanje ćelijskih odgovora na upalu. Nakon aktivacije s LPS-om, RAW264 makrofagi aktiviraju upalne puteve i luče nekoliko inflamatornih posrednika, kao što su TNF-α, COX-2, IL-1β, iNOS i IL-6 [
20]. Ova studija je procijenila anti-nociceptivne i antiinflamatorne efekte A. lappa protiv OA u životinjskom modelu MIA, životinjskom modelu izazvanom octenom kiselinom i ćelijama RAW264.7 aktiviranim LPS-om.
2. Materijali i metode
2.1. Biljni materijal
Osušeni korijen A. lappa DC. korišteno u eksperimentu nabavljeno je od Epulip Pharmaceutical Co., Ltd., (Seul, Koreja). Identifikovao ga je prof. Donghun Lee, odjel za biljnu farmakologiju, pukovnik korejske medicine, Univerzitet Gachon, a broj uzorka vaučera je deponovan kao 18060301.
2.2. HPLC analiza ekstrakta A. lappa
A. lappa je ekstrahirana pomoću aparata za refluks (destilirana voda, 3 h na 100 °C). Ekstrahirana otopina je filtrirana i kondenzirana pomoću isparivača niskog pritiska. Ekstrakt A. lappa imao je prinos od 44,69% nakon sušenja zamrzavanjem pod -80 °C. Hromatografska analiza A. lappa je sprovedena pomoću HPLC spojenog pomoću 1260 InfinityⅡ HPLC sistema (Agilent, Pal Alto, Kalifornija, SAD). Za hromatsku separaciju korištena je EclipseXDB C18 kolona (4,6 × 250 mm, 5 µm, Agilent) na 35 °C. Ukupno 100 mg uzorka je razrijeđeno u 10 mL 50% metanola i obrađeno ultrazvukom 10 minuta. Uzorci su filtrirani pomoću filtera šprica (Waters Corp., Milford, MA, SAD) od 0,45 μm. Sastav mobilne faze bio je 0,1% fosforne kiseline (A) i acetonitrila (B), a kolona je eluirana na sljedeći način: 0-60 min, 0%; 60–65 min, 100%; 65–67 min, 100%; 67–72 min, 0% rastvarača B sa brzinom protoka od 1,0 mL/min. Efluent je posmatran na 210 nm korišćenjem injekcionog volumena od 10 μL. Analiza je obavljena u tri primjerka.
2.3. Smještaj i upravljanje životinjama
Mužjaci Sprague-Dawley (SD) pacova stari 5 sedmica i mužjaci ICR miševa starosti 6 sedmica kupljeni su od Samtako Bio Korea (Gyeonggi-do, Koreja). Životinje su držane u prostoriji uz konstantnu temperaturu (22 ± 2 °C) i vlažnost (55 ± 10%) i ciklus svjetlo/mrak od 12/12 h. Životinje su bile upoznate sa stanjem više od nedelju dana pre početka eksperimenta. Životinje su imale ad libitum zalihe hrane i vode. Trenutna etička pravila za brigu o životinjama i rukovanje na Univerzitetu Gachon (GIACUC-R2019003) striktno su poštovana u svim eksperimentalnim postupcima na životinjama. Studija je osmišljena kao istraživačko zaslijepljeno i paralelno ispitivanje. Pratili smo metodu eutanazije prema smjernicama Etičkog odbora za eksperimentalnu etiku na životinjama.
2.4. MIA injekcije i tretman
Pacovi su nasumično podijeljeni u 4 grupe, a to su lažna, kontrolna, indometacin i A. lappa. Nakon anesteziranja sa 2% mješavinom izofluorana O2, pacovima je ubrizgano 50 μL MIA (40 mg/m; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) intraartikularno u zglobove koljena kako bi se došlo do eksperimentalne OA. Tretmani su sprovedeni na sledeći način: kontrolna i lažna grupa su održavane samo sa osnovnom dijetom AIN-93G. Samo, indometacinska grupa je dobila indometacin (3 mg/kg) uključen u AIN-93G ishranu, a grupa A. lappa od 300 mg/kg je dodijeljena AIN-93G ishrani uz dodatak A. lappa (300 mg/kg). Tretmani su nastavljeni 24 dana od dana indukcije OA po stopi od 15-17 g po 190-210 g tjelesne težine na dnevnoj bazi.
2.5. Merenje težine
Nakon indukcije OA, mjerenje nosivosti stražnjih udova pacova izvršeno je pomoću incapacitance-MeterTester600 (IITC Life Science, Woodland Hills, Kalifornija, SAD) prema rasporedu. Izračunata je raspodjela težine na stražnjim udovima: nosivost (%)
